کشت سلولی
تنظیم ترانسفکشن
ترانسفکشن را از مقدار DNA هر چاهک و نسبت معرفبهDNA روی کل پلیت مقیاس میزند، با مقدار اضافه تا مسترمیکس هدررفت پیپت را بپوشاند. ابزار حساب میکند؛ مقدار DNA و نسبت باید از پروتکل معرف و بهینهسازی خودتان بیاید.
—
مسترمیکس
| جزء | هر چاهک | کل با احتساب اضافه |
|---|
نسبت و مقدار DNA کاملاً به معرف و رده سلولی شما بستگی دارد — آنها را از پروتکل معرف بردارید. این ابزار حساب میکند؛ عددِ درستِ آزمایش شما را نمیداند.
DNA هر چاهک یا مستقیم وارد میشود یا از مقدار در هر سانتیمتر مربع ضربدر سطح کشت ظرف بهدست میآید. حجم معرف برابر DNA ضربدر نسبتی است که وارد میکنید. کلها مقدار اضافه را حمل میکنند تا مسترمیکس هدررفت پیپتکردن همهٔ چاهکها را بپوشاند. محیط کمسرم برای تشکیل کمپلکس اختیاری است و به همان روش مقیاس میخورد.
فرمول
معرف هر چاهک = DNA هر چاهک × نسبت؛ کل = هر چاهک × چاهکها × (۱ + اضافه)
- DNA هر چاهک
- مستقیم واردشده، یا مقدار در هر سانتیمتر مربع ضربدر سطح کشت ظرف
- نسبت
- میکرولیتر معرف بهازای هر میکروگرم DNA، از دیتاشیت معرف
- اضافه
- درصدی که افزوده میشود تا مخلوط در همهٔ چاهکها کم نیاید
مثال حلشده
نیم میکروگرم هر چاهک با نسبت ۳:۱ روی ۲۴ چاهک
- ۰٫۵ میکروگرم DNA هر چاهک
- نسبت ۳ µl/µg
- ۲۴ چاهک، ۱۰ درصد اضافه
- معرف هر چاهک: ۰٫۵ ضربدر ۳ برابر ۱٫۵ میکرولیتر.
- ضریب کاری: ۲۴ ضربدر ۱٫۱۰ برابر ۲۶٫۴ چاهکمعادل.
- کلها: ۱۳٫۲ میکروگرم DNA و ۳۹٫۶ میکرولیتر معرف.
پاسخ ۱٫۵ میکرولیتر معرف هر چاهک؛ ۱۳٫۲ میکروگرم و ۳۹٫۶ میکرولیتر برای پلیت
خطاهای رایج
- قرضگرفتن نسبت از معرف دیگر. معرفهای لیپیدی، PEI و دیگران چندبرابر فرق دارند؛ نسبت درست همانی است که روی برگهٔ محصول شماست و برای سلولهایتان تنظیم شده.
- حذف اضافه در چاهکهای کوچک. حجم مرده و ماندگاری نوک در مقیاس ۹۶چاهکی بیشترین گزند را میزند؛ بدون حاشیه، چاهکهای آخر کم میآیند.
- فراموشکردن نقش کانفلوئنسی در بازده. ماشینحساب مخلوط را اندازه میزند، نه زیستشناسی را؛ تا تراکمی که پروتکل فرض میکند کشت کنید.
پرسشهای متداول
میکروگرم هر چاهک یا نانوگرم هر سانتیمتر مربع؟
هر چاهک برای پلیتهای استاندارد راحت است. هر سانتیمتر مربع بین قالبهای ظرف بهتر منتقل میشود، چون با سطح کشت خودکار مقیاس میخورد.
آیا PEI را با نسبت نیتروژنبهفسفات پوشش میدهد؟
نه. از نسبت حجمبهجرم استفاده میکند که معرفهای لیپیدی و بسیاری پلیمری با آن مشخص میشوند. محاسبهٔ N:P ورودی متفاوت میخواهد و خارج از دامنهٔ اینجاست.
چه مقدار اضافه بگذارم؟
ده درصد نقطهٔ شروع رایج است؛ برای چاهکهای کوچک زیاد یا مرحلهٔ مولتیکانال بالاتر، برای چند چاهک بزرگ پایینتر.