Клеточная культура
Настройка трансфекции
Масштабирует трансфекцию по количеству ДНК на лунку и соотношению реагент-ДНК на весь планшет с запасом, чтобы мастер-микс покрывал потери при пипетировании. Инструмент считает; количество ДНК и соотношение должны идти из протокола реагента и вашей оптимизации.
—
Мастер-микс
| Компонент | На лунку | Всего с запасом |
|---|
Соотношение и количество ДНК полностью зависят от вашего реагента и линии клеток — берите их из протокола реагента. Инструмент делает арифметику; он не знает правильных чисел для вашего эксперимента.
ДНК на лунку вводится напрямую либо выводится из количества на квадратный сантиметр, умноженного на площадь роста сосуда. Объём реагента — это ДНК, умноженная на введённое соотношение. Итоги несут запас, чтобы мастер-микс покрывал потери при пипетировании по всем лункам. Среда с пониженной сывороткой для образования комплекса необязательна и масштабируется так же.
Формула
реагент на лунку = ДНК на лунку × соотношение; всего = на лунку × лунки × (1 + запас)
- ДНК на лунку
- вводится напрямую или как количество на см², умноженное на площадь роста сосуда
- соотношение
- микролитры реагента на микрограмм ДНК, из паспорта реагента
- запас
- процент, добавляемый, чтобы смеси хватило на все лунки
Разобранный пример
Полмикрограмма на лунку при 3:1 на 24 лунки
- 0,5 мкг ДНК на лунку
- соотношение 3 мкл/мкг
- 24 лунки, запас 10 процентов
- Реагент на лунку: 0,5 умножить на 3 — это 1,5 мкл.
- Рабочий множитель: 24 умножить на 1,10 — это 26,4 лунки-эквивалента.
- Итоги: 13,2 мкг ДНК и 39,6 мкл реагента.
Ответ 1,5 мкл реагента на лунку; 13,2 мкг и 39,6 мкл на планшет
Частые ошибки
- Заимствовать соотношение у другого реагента. Липидные реагенты, PEI и прочие различаются в разы; верное соотношение — то, что в паспорте вашего продукта, доведённое под ваши клетки.
- Пропускать запас на малых лунках. Мёртвый объём и удержание в наконечнике бьют сильнее всего в 96-луночном масштабе; без поля последние лунки недобирают.
- Забывать, что эффективность задаёт конфлюэнтность. Калькулятор размеряет смесь, а не биологию; сейте до плотности, которую предполагает протокол.
Частые вопросы
Микрограммы на лунку или нанограммы на см²?
На лунку удобно для стандартных планшетов. На см² лучше переносится между форматами сосудов, ведь масштабируется по площади роста автоматически.
Учитывает ли это PEI по соотношению азот-фосфат?
Нет. Используется объём-массовое соотношение, которым задают липидные и многие полимерные реагенты. Расчёт N:P требует иных данных и здесь вне области.
Какой запас брать?
Десять процентов — обычная отправная точка; выше для многих малых лунок или многоканального шага, ниже для нескольких больших.