کشت سلولی
شمارش سلول
شمارش لام هموسیتومتر را به غلظت و تعداد کل تبدیل میکند و میگوید برای رسیدن به تعداد معیّن سلول چه حجمی از سوسپانسیون بردارید. اگر شمارشگر شما خودش غلظت میدهد، به حالت دوم بروید و از حساب مربعها بگذرید.
کل و حجم لازم
کل سلول برابر غلظت ضربدر حجمی است که وارد میکنید. عدد آخر میگوید چه مقدار از این سوسپانسیون را بردارید تا به تعداد هدف برسید.
ضریب ۱۰⁴ با اتاقک استاندارد نئوبار ثابت است، جایی که هر مربع بزرگ گوشه ۰٫۱ میکرولیتر جا میگیرد. ضریب رقت یعنی رقت نمونه پیش از بارگذاری — برای مخلوط ۱:۱ با تریپانبلو برابر ۲. چند مربع بشمارید و میانگین بگیرید؛ هرچه سلول بیشتری شمرده شود، خطای شمارش کمتر است.
فرمول
غلظت = (سلول شمردهشده ÷ مربع شمردهشده) × ضریب رقت × ۱۰⁴
- سلول شمردهشده
- مجموع شمردهشده در مربعهای بزرگی که ارزیابی کردید
- مربع شمردهشده
- تعداد مربعهای بزرگ گوشه که شمردید، معمولاً چهار
- ضریب رقت
- رقت پیش از بارگذاری؛ برای مخلوط ۱:۱ با تریپانبلو برابر ۲
- ۱۰⁴
- با اتاقک ثابت است: هر مربع بزرگ ۰٫۱ میکرولیتر جا میگیرد و در هر میلیلیتر ۱۰⁴ از آنهاست
مثال حلشده
شمارش چهار مربع با مخلوط ۱:۱ تریپان
- ۱۸۰ سلول در ۴ مربع
- ضریب رقت ۲
- حجم سوسپانسیون ۱۰ میلیلیتر
- میانگین هر مربع: ۱۸۰ تقسیم بر ۴ برابر ۴۵.
- غلظت: ۴۵ ضربدر ۲ ضربدر ۱۰⁴ برابر ۹×۱۰⁵ سلول در میلیلیتر.
- کل: ۹×۱۰⁵ ضربدر ۱۰ میلیلیتر برابر ۹×۱۰⁶ سلول.
پاسخ ۹×۱۰⁵ سلول در میلیلیتر، ۹×۱۰⁶ در کل
خطاهای رایج
- فراموشکردن ضریب رقت. اگر یک بخش سلول را با یک بخش تریپانبلو مخلوط کردهاید، نمونه دو برابر رقیق است؛ گذاشتن ضریب روی ۱ شمارش را نصف میکند.
- کمشمردن سلول. زیر حدود ده در هر مربع، شمارش تابع شانس میشود؛ مربع بیشتری یا نمونهٔ غلیظتری بشمارید تا کل شمردهشده به صدها برسد.
- شمردن کلامپ بهجای یک سلول. ابتدا با تریپسین به سوسپانسیون تکسلولی برسید، وگرنه غلظت کم و زندهمانی نادرست خوانده میشود.
پرسشهای متداول
سلولهای روی مرز را چطور بشمارم؟
دو ضلع هر مربع، مثلاً بالا و چپ، را انتخاب کنید و سلولهای چسبیده به آنها را بشمارید و دو ضلع دیگر را نادیده بگیرید. با اجرای یکنواخت، از شمارش دوبارهٔ یک سلول جلوگیری میشود.
آیا ضریب ۱۰⁴ تغییر میکند؟
فقط اگر اتاقک شما عمق استاندارد ۰٫۱ میلیمتر نداشته باشد. برای نئوبار بهبودیافتهٔ معمول ثابت است. اتاقک متفاوت، ضریب خودش را دارد.
چرا چند مربع را میانگین بگیرم؟
سلولها ناهموار تهنشین میشوند. میانگین چهار گوشه و در حالت ایدهآل تکرار پرکردن، خطای پیپت و توزیع را هموار میکند.