کشت سلولی
زندهمانی با تریپانبلو
از شمارش زنده و مرده زیر تریپانبلو، درصد زندهمانی، غلظت سلول زنده و مرده و کل، و حجم لازم برای تعداد هدفِ سلول زنده را میدهد. سلول مرده رنگ را میگیرد و آبی میشود؛ سلول زنده آن را پس میزند و شفاف میماند.
بازده سلول زنده
زندهمانی یعنی سلول زنده تقسیم بر کل. غلظتها همان حساب هموسیتومترِ ابزار شمارش را دارند: میانگین سلول در هر مربع ضربدر ضریب رقت ضربدر ۱۰⁴. حداقل زندهمانی جهانی وجود ندارد — قابل قبول بودن به رده و کاربرد پاییندستی بستگی دارد — پس این ابزار عدد را گزارش میکند نه اینکه دربارهٔ آن قضاوت کند. اتاقک را چند دقیقه پس از افزودن تریپانبلو بخوانید، چون مواجههٔ طولانی سلولها را میکشد و زندهمانی ظاهری را پایین میآورد.
فرمول
زندهمانی = زنده ÷ (زنده + مرده) × ۱۰۰
- زنده
- سلولهای شفاف و بیرنگ شمردهشده
- مرده
- سلولهای آبی و پر از رنگ شمردهشده
- غلظت زنده
- (زنده ÷ مربع) × ضریب رقت × ۱۰⁴
مثال حلشده
شمارش ۱۸۴ شفاف و ۱۶ آبی
- ۱۸۴ زنده، ۱۶ مرده در ۴ مربع
- ضریب رقت ۲
- حجم سوسپانسیون ۱۰ میلیلیتر
- زندهمانی: ۱۸۴ از ۲۰۰ برابر ۹۲ درصد.
- غلظت زنده: ۱۸۴ بر ۴، ضربدر ۲، ضربدر ۱۰⁴، برابر ۹٫۲×۱۰⁵ در میلیلیتر.
- کل زنده در ۱۰ میلیلیتر: ۹٫۲×۱۰⁶.
پاسخ ۹۲ درصد زنده، ۹٫۲×۱۰⁵ سلول زنده در میلیلیتر
خطاهای رایج
- ماندن طولانی سلولها در تریپانبلو. رنگ سمی است؛ ظرف چند دقیقه بخوانید وگرنه زندهمانی به دلایلی بیربط به تیمار شما پایین میرود.
- برخورد با درصد ثابت بهعنوان قبول یا رد. قابلقبول بودن به رده و سنجش پیشرو بستگی دارد؛ یک ایزولهٔ اولیه و یک رده سلولی مقاوم آستانهٔ یکسان ندارند.
- امتیازدهی ناهماهنگ به سلولهای کمرنگ. پیش از شروع تصمیم بگیرید که سلول کمرنگ زنده است یا مرده و همان را در همهٔ مربعها و نمونهها اجرا کنید.
پرسشهای متداول
آیا تریپانبلو نزدیک انتهای پایین قابلاتکاست؟
یکپارچگی غشا را گزارش میکند نه سلامت متابولیک، و آپوپتوز زودرس را کمشمار میکند. برای زندهمانیای که باید دفاعپذیر باشد، با روش دوم تأیید کنید.
برای کشت، سلول مرده را بشمارم؟
نه. بر پایهٔ غلظت زنده کشت کنید؛ به همین دلیل این ابزار آن را جدا میکند و حجم را از سلول زنده حساب میکند نه کل.
چرا غلظت کل پس از تیمار افت کرد؟
سلولهای مرده لیز و ناپدید میشوند، پس تیمار شدید میتواند همزمان زندهمانی و شمارش کل را پایین آورد. با کنترلی که به همان روش شمرده شده مقایسه کنید.