Клеточная культура
Жизнеспособность с трипановым синим
По числу живых и мёртвых под трипановым синим даёт процент жизнеспособности, концентрацию живых, мёртвых и всех клеток и объём суспензии для нужного числа живых клеток. Мёртвые клетки берут краситель и синеют; живые его исключают и остаются прозрачными.
Выход живых клеток
Жизнеспособность — это живые клетки, делённые на общее число. Концентрации считаются той же арифметикой камеры, что и в инструменте подсчёта: среднее число клеток на квадрат, умноженное на коэффициент разведения и на 10⁴. Универсального минимума жизнеспособности нет — приемлемость зависит от линии и последующего применения, — поэтому инструмент сообщает значение, а не оценивает его. Считывайте камеру в течение нескольких минут после добавления трипанового синего: долгая экспозиция убивает клетки и занижает видимую жизнеспособность.
Формула
жизнеспособность = живые ÷ (живые + мёртвые) × 100
- живые
- подсчитанные прозрачные, неокрашенные клетки
- мёртвые
- подсчитанные синие, заполненные красителем клетки
- концентрация живых
- (живые ÷ квадраты) × коэффициент разведения × 10⁴
Разобранный пример
Подсчёт 184 прозрачных и 16 синих
- 184 живых, 16 мёртвых в 4 квадратах
- коэффициент разведения 2
- объём суспензии 10 мл
- Жизнеспособность: 184 из 200 — это 92 процента.
- Концентрация живых: 184 на 4, умножить на 2, на 10⁴ — это 9,2 × 10⁵ на мл.
- Всего живых в 10 мл: 9,2 × 10⁶.
Ответ 92 процента жизнеспособны, 9,2 × 10⁵ живых клеток на мл
Частые ошибки
- Слишком долго держать клетки в трипановом синем. Краситель токсичен; считывайте за несколько минут, иначе жизнеспособность падает по причинам, не связанным с вашим воздействием.
- Считать фиксированный процент за проход или брак. Приемлемость зависит от линии и предстоящего теста; первичный изолят и стойкая линия не делят один порог.
- Непоследовательно оценивать бледные клетки. Решите до начала, живая бледная клетка или мёртвая, и применяйте это одинаково во всех квадратах и образцах.
Частые вопросы
Надёжен ли трипановый синий у нижней границы?
Он отражает целостность мембраны, а не метаболическое здоровье, и недоучитывает ранний апоптоз. Для защищаемой жизнеспособности подтвердите вторым методом.
Считать ли мёртвые клетки для посева?
Нет. Сейте по концентрации живых; поэтому инструмент её выделяет и считает объём от живых клеток, а не от всех.
Почему общая концентрация упала после воздействия?
Мёртвые клетки лизируются и исчезают, так что жёсткое воздействие может разом снизить и жизнеспособность, и общий счёт. Сравнивайте с контролем, посчитанным так же.