پروتئین
دستور ژل SDS-PAGE
حجم اجزای لازم برای ریختن ژل SDS-PAGE را درمیآورد. درصد و حجم ژل جداکننده و متراکمکننده و تعداد ژلها را بگذارید؛ ابزار یک دستور استاندارد لاملی را مقیاس میزند و آب را مانده در نظر میگیرد.
ژل جداکننده
| جزء | حجم |
|---|
ژل متراکمکننده
| جزء | حجم |
|---|
دستور استاندارد لاملی. آب مانده پس از بقیهٔ اجزاست، پس اول آن را بریزید، سپس آکریلآمید، بافر و SDS، و APS و TEMED را آخر بیفزایید چون پلیمریزاسیون را آغاز میکنند. هواگیری کنید یا سریع کار کنید. آکریلآمید پیش از بستن نوروتوکسین است — محلول پلیمرنشده را با دستکش جابهجا کنید.
فرمول
آکریلآمید = حجم × (%T ÷ درصد استوک)؛ آب = حجم − بقیهٔ اجزا
- %T
- درصد کل آکریلآمید ژل
- درصد استوک
- غلظت استوک آکریلآمید/بیس شما، معمولاً ۳۰٪
- بافر جداکننده
- تریس-HCl ۱٫۵ مولار pH 8.8، بهاندازهٔ یکچهارم حجم
- بافر متراکمکننده
- تریس-HCl ۱٫۰ مولار pH 6.8، بهاندازهٔ یکهشتم حجم
مثال حلشده
ژل جداکنندهٔ ۱۰٪، ۱۰ میلیلیتر
- %T برابر ۱۰
- استوک ۳۰٪
- حجم ۱۰ میلیلیتر
- آکریلآمید: ۱۰ × (۱۰ ÷ ۳۰) برابر ۳٫۳۳ میلیلیتر.
- بافر جداکننده: یکچهارم ۱۰ برابر ۲٫۵ میلیلیتر.
- آب: مانده، حدود ۴٫۰ میلیلیتر.
پاسخ ۳٫۳۳ میلیلیتر آکریلآمید، ۲٫۵ میلیلیتر بافر، حدود ۴٫۰ میلیلیتر آب، بهاضافهٔ SDS و APS و TEMED
خطاهای رایج
- زود افزودن APS و TEMED. اینها پلیمریزاسیون را آغاز میکنند، پس آخر بیفزایید و سریع بریزید، وگرنه ژل در لوله میبندد.
- استفاده از بافر نادرست برای هر لایه. ژل جداکننده pH 8.8 و متراکمکننده pH 6.8 میخواهد؛ جابهجاییشان تراکم و تیزی باند را خراب میکند.
- دستزدن به آکریلآمید پلیمرنشده بدون دستکش. مونومر نوروتوکسین است؛ فقط ژل بستهٔشده را میتوان با دست برهنه گرفت.
پرسشهای متداول
چه درصدی بهکار ببرم؟
درصد کمتر پروتئینهای بزرگ را و درصد بیشتر پروتئینهای کوچک را تفکیک میکند. ژل ۱۰٪ همهکارهای خوب است؛ برای پروتئین کوچک تا ۱۲–۱۵٪ و برای بزرگ ۷٫۵٪ بروید.
چرا ژل من پلیمریزه نمیشود؟
APS کهنه مقصر معمول است — تازه بسازید یا آلیکوت منجمد نگه دارید. TEMED کم یا اتاق سرد هم کندش میکند.
با این میتوانم ژل گرادیانی بسازم؟
نه، این یک درصد در هر لایه میریزد. گرادیان به دو مخلوط و گرادیانساز نیاز دارد که کار متفاوتی است.