Белки
Рецепт геля SDS-PAGE
Рассчитывает объёмы компонентов для заливки гелей SDS-PAGE. Задайте проценты и объёмы разделяющего и концентрирующего гелей и число гелей; инструмент масштабирует стандартный рецепт Лэммли, а вода идёт остатком.
Разделяющий гель
| Компонент | Объём |
|---|
Концентрирующий гель
| Компонент | Объём |
|---|
Стандартный рецепт по Лэммли. Вода — остаток после прочих компонентов, поэтому налейте её первой, затем акриламид, буфер и SDS, а APS и TEMED добавьте последними, так как они запускают полимеризацию. Дегазируйте или работайте быстро. До застывания акриламид — нейротоксин; работайте с неполимеризованным раствором в перчатках.
Формула
акриламид = объём × (%T ÷ % исходного); вода = объём − все прочие компоненты
- %T
- общий процент акриламида геля
- % исходного
- концентрация исходного раствора акриламид/бис, обычно 30%
- разделяющий буфер
- 1,5 М Tris-HCl pH 8,8, четверть объёма
- концентрирующий буфер
- 1,0 М Tris-HCl pH 6,8, восьмая часть объёма
Разобранный пример
10% разделяющий гель, 10 мл
- %T 10
- исходный 30%
- объём 10 мл
- Акриламид: 10 × (10 ÷ 30) — это 3,33 мл.
- Разделяющий буфер: четверть 10 — это 2,5 мл.
- Вода: остаток, около 4,0 мл.
Ответ 3,33 мл акриламида, 2,5 мл буфера, ~4,0 мл воды, плюс SDS, APS и TEMED
Частые ошибки
- Добавлять APS и TEMED слишком рано. Они запускают полимеризацию, поэтому добавляйте их последними и заливайте быстро, иначе гель застынет в пробирке.
- Использовать не тот буфер для слоя. Разделяющему гелю нужен pH 8,8, концентрирующему — pH 6,8; их перестановка портит концентрацию и резкость полос.
- Работать с неполимеризованным акриламидом без перчаток. Мономер — нейротоксин; голыми руками безопасен только застывший гель.
Частые вопросы
Какой процент выбрать?
Меньший процент разделяет крупные белки, больший — мелкие. 10% гель универсален; для мелких белков берите 12–15%, для крупных 7,5%.
Почему гель не полимеризуется?
Обычно виноват старый APS — готовьте свежий или держите замороженные аликвоты. Мало TEMED или холодная комната тоже замедляют.
Можно ли сделать градиентный гель?
Нет, здесь заливается один процент на слой. Градиент требует двух смесей и градиентного смесителя — другой рабочий процесс.