پروتئین
رقت آنتیبادی وسترنبلات
حجم آنتیبادی و رقیقکننده را برای وسترنبلات روی چند غشا مقیاس میزند. حجم انکوباسیون هر غشا، تعداد غشا و مقدار اضافه، و رقت اولیه و ثانویه را وارد کنید؛ ابزار آنتیبادی و رقیقکنندهٔ هر مرحله را میدهد.
| مرحله | رقت | آنتیبادی | رقیقکننده |
|---|
حجم آنتیبادی برابر حجم کل انکوباسیون تقسیم بر ضریب رقت است؛ رقیقکننده بقیه است. کل، تعداد غشا و مقدار اضافه را حمل میکند تا ظرف یا کیسهٔ مشترک کم نیاید. رقت بهینه برای هر آنتیبادی و لات خاص است — از برگهٔ داده بگیرید و با تیتراسیون تنظیم کنید.
فرمول
آنتیبادی = کل ÷ رقت؛ کل = حجم هر غشا × غشاها × (۱ + اضافه)
- حجم هر غشا
- حجم انکوباسیونی که یک غشا لازم دارد
- رقت
- ضریب رقت آنتیبادی، بهصورت ۱:X
- اضافه
- حاشیهای تا ظرف یا کیسهٔ مشترک کم نیاید
مثال حلشده
اولیهٔ ۱:۱۰۰۰ روی دو غشا
- ۵ میلیلیتر هر غشا
- ۲ غشا، ۱۰٪ اضافه
- اولیه ۱:۱۰۰۰
- کل: ۵ × ۲ × ۱٫۱۰ برابر ۱۱ میلیلیتر.
- آنتیبادی: ۱۱ میلیلیتر ÷ ۱۰۰۰ برابر ۱۱ میکرولیتر.
- رقیقکننده: ۱۰٫۹۸۹ میلیلیتر باقیمانده.
پاسخ ۱۱ میکرولیتر آنتیبادی اولیه در حدود ۱۱ میلیلیتر رقیقکننده
خطاهای رایج
- اعتماد کورکورانه به رقت برگهٔ داده. آن نقطهٔ شروع است؛ بهترین رقت کاری به لیزات، مواجهه و لات شما بستگی دارد و ارزش یکبار تیتراسیون را دارد.
- فراموشکردن اضافه. ظرف و کیسه حجم مرده دارند؛ بدون حاشیه، آخرین غشا در آنتیبادی بسیار کم میماند.
- استفادهٔ مکرر از ثانویهٔ رقیقشده. هر بار استفاده تیتر مؤثر را افت میدهد؛ ثبت کنید یک آنتیبادی رقیقشده چند بار استفاده شده.
پرسشهای متداول
دستور بافر را اینجا بیاورم؟
ابزار بافرها TBST، بافر انتقال و بافر ران را دارد و مقیاس میزند. این ابزار رقت آنتیبادی را پوشش میدهد که ابزار بافرها نمیدهد.
آیا نوع رقیقکننده مهم است؟
بله — عامل بلاک در رقیقکننده بر زمینه اثر میگذارد. این ابزار حجم را اندازه میزند؛ انتخاب بلاکر تصمیم روشی برای آنتیبادی شماست.
بیش از دو آنتیبادی اضافه کنم؟
جدول یک اولیه و یک ثانویه را پوشش میدهد، جفت معمول. برای مالتیپلکس، ابزار را برای هر آنتیبادی با رقت خودش یکبار اجرا کنید.