Protéines
Recette de gel SDS-PAGE
Calcule les volumes des composants pour couler des gels SDS-PAGE. Réglez les pourcentages et volumes des gels de séparation et de concentration et le nombre de gels ; l’outil met à l’échelle une recette Laemmli standard, l’eau servant de complément.
Gel de séparation
| Composant | Volume |
|---|
Gel de concentration
| Composant | Volume |
|---|
Une recette Laemmli standard. L’eau est le complément après les autres composants : ajoutez-la d’abord, puis l’acrylamide, le tampon et le SDS, et l’APS et le TEMED en dernier car ils déclenchent la polymérisation. Dégazez ou travaillez vite. Avant prise, l’acrylamide est un neurotoxique — manipulez la solution non polymérisée avec des gants.
Formule
acrylamide = volume × (%T ÷ % mère) ; eau = volume − tous les autres composants
- %T
- le pourcentage total d’acrylamide du gel
- % mère
- la concentration de votre solution mère d’acrylamide/bis, souvent 30 %
- tampon de séparation
- Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, au quart du volume
- tampon de concentration
- Tris-HCl 1,0 M pH 6,8, au huitième du volume
Exemple résolu
Un gel de séparation à 10 %, 10 ml
- %T 10
- mère 30 %
- volume 10 ml
- Acrylamide : 10 × (10 ÷ 30) donne 3,33 ml.
- Tampon de séparation : le quart de 10 donne 2,5 ml.
- Eau : le complément, environ 4,0 ml.
Réponse 3,33 ml d’acrylamide, 2,5 ml de tampon, ~4,0 ml d’eau, plus SDS, APS et TEMED
Erreurs courantes
- Ajouter l’APS et le TEMED trop tôt. Ils déclenchent la polymérisation : ajoutez-les en dernier et coulez vite, sinon le gel prend dans le tube.
- Utiliser le mauvais tampon par couche. Le gel de séparation veut pH 8,8, celui de concentration pH 6,8 ; les inverser gâche la concentration et la netteté des bandes.
- Manipuler l’acrylamide non polymérisé sans gants. Le monomère est un neurotoxique ; seul le gel pris se manipule à mains nues.
Questions fréquentes
Quel pourcentage choisir ?
Un pourcentage plus faible résout les grosses protéines, plus élevé les petites. Un gel à 10 % est polyvalent ; montez à 12–15 % pour les petites et 7,5 % pour les grosses.
Pourquoi mon gel ne polymérise-t-il pas ?
L’APS vieux est le coupable habituel — préparez-le frais ou gardez des aliquotes congelées. Trop peu de TEMED ou une pièce froide ralentissent aussi.
Puis-je faire un gel en gradient ?
Non, ceci coule un seul pourcentage par couche. Un gradient exige deux mélanges et un formeur de gradient, un autre flux de travail.