Белки
Разведение антител для вестерн-блота
Масштабирует объёмы антитела и разбавителя для вестерн-блота на нескольких мембранах. Введите объём инкубации на мембрану, число мембран и запас, а также первичное и вторичное разведения; инструмент даёт антитело и разбавитель для каждого этапа.
| Этап | Разведение | Антитело | Разбавитель |
|---|
Объём антитела — это общий объём инкубации, делённый на кратность разведения; разбавитель — остаток. Итог несёт число мембран и запас, чтобы общего лотка или пакета хватило. Оптимальные разведения специфичны для антитела и партии — берите их из паспорта и уточняйте титрованием.
Формула
антитело = всего ÷ разведение; всего = объём на мембрану × мембраны × (1 + запас)
- объём на мембрану
- объём инкубации, нужный одной мембране
- разведение
- кратность разведения антитела, вводится как 1:X
- запас
- поле, чтобы общего лотка или пакета хватило
Разобранный пример
Первичное 1:1000 на двух мембранах
- 5 мл на мембрану
- 2 мембраны, запас 10%
- первичное 1:1000
- Всего: 5 × 2 × 1,10 — это 11 мл.
- Антитело: 11 мл ÷ 1000 — это 11 мкл.
- Разбавитель: оставшиеся 10,989 мл.
Ответ 11 мкл первичного антитела в ~11 мл разбавителя
Частые ошибки
- Слепо доверять разведению из паспорта. Это отправная точка; лучшее рабочее разведение зависит от лизата, экспозиции и партии и стоит однократного титрования.
- Забывать про запас. Лотки и пакеты оставляют мёртвый объём; без поля последняя мембрана лежит в слишком малом объёме антитела.
- Слишком часто повторно использовать разведённое вторичное. Каждое повторное использование снижает эффективный титр; отмечайте, сколько раз использовано разведённое антитело.
Частые вопросы
Включать ли сюда рецепт буфера?
Инструмент буферов содержит TBST, буфер переноса и электродный буфер и масштабирует их. Этот инструмент покрывает разведение антитела, чего инструмент буферов не делает.
Важен ли разбавитель?
Да — блокирующий агент в разбавителе влияет на фон. Инструмент задаёт объём; выбор блокатора — методическое решение для вашего антитела.
Можно ли добавить больше двух антител?
Таблица охватывает первичное и вторичное — обычную пару. Для мультиплекса запустите инструмент по разу на каждое антитело с его разведением.