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Dilution d’anticorps pour western blot
Met à l’échelle les volumes d’anticorps et de diluant pour un western blot sur plusieurs membranes. Entrez le volume d’incubation par membrane, le nombre de membranes et une marge, et les dilutions primaire et secondaire ; l’outil donne l’anticorps et le diluant de chaque étape.
| Étape | Dilution | Anticorps | Diluant |
|---|
Le volume d’anticorps est le volume total d’incubation divisé par le facteur de dilution ; le diluant est le reste. Le total intègre le nombre de membranes et la marge pour qu’un bac ou sachet commun ne manque pas. Les dilutions optimales sont propres à l’anticorps et au lot — prenez-les sur la fiche et affinez par titrage.
Formule
anticorps = total ÷ dilution ; total = volume par membrane × membranes × (1 + marge)
- volume par membrane
- le volume d’incubation qu’une membrane requiert
- dilution
- le facteur de dilution de l’anticorps, entré en 1:X
- marge
- un jeu pour qu’un bac ou sachet commun ne manque pas
Exemple résolu
Un primaire 1:1000 sur deux membranes
- 5 ml par membrane
- 2 membranes, marge 10 %
- primaire 1:1000
- Total : 5 × 2 × 1,10 donne 11 ml.
- Anticorps : 11 ml ÷ 1000 donne 11 µl.
- Diluant : les 10,989 ml restants.
Réponse 11 µl d’anticorps primaire dans ~11 ml de diluant
Erreurs courantes
- Se fier aveuglément à la dilution de la fiche. C’est un point de départ ; la meilleure dilution de travail dépend de votre lysat, de l’exposition et du lot, et mérite un titrage.
- Oublier la marge. Bacs et sachets laissent un volume mort ; sans marge, la dernière membrane baigne dans trop peu d’anticorps.
- Réutiliser trop souvent le secondaire dilué. Chaque réutilisation baisse le titre effectif ; notez combien de fois un anticorps dilué a servi.
Questions fréquentes
Faut-il inclure la recette du tampon ici ?
L’outil des tampons contient TBST, le tampon de transfert et le tampon de migration et les met à l’échelle. Cet outil couvre la dilution d’anticorps, que l’outil des tampons ne fait pas.
Le diluant importe-t-il ?
Oui — l’agent bloquant du diluant influe sur le fond. Cet outil dimensionne le volume ; le choix du bloquant est une décision de méthode pour votre anticorps.
Puis-je ajouter plus de deux anticorps ?
La table couvre un primaire et un secondaire, la paire habituelle. Pour un multiplex, lancez l’outil une fois par anticorps avec sa dilution.